為了微生物檢驗(yàn)的順利開展，最大限度地避免雜菌污染，需要我們熟練并規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，無菌操作是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
一、無菌操作技術(shù)
1、定義
是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法；
無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。
2、內(nèi)容
無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：
1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；
2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺(tái)的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。
3、無菌操作原則
1）在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時(shí)必須穿工作服、戴工作帽應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>
2）在操作前20～30分鐘要先啟動(dòng)超凈臺(tái)和紫外燈，進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼3次后使用。嚴(yán)禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；
3）從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；
4）接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；
5）接種環(huán)或接種針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；
6）吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。
二、無菌操作的環(huán)境要求
1、無菌室
（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間；
（2）無菌室的消毒和防污染
（3）無菌室使用要求
①無菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺(tái)面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品；
②無菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時(shí)間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；
③處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。
2、超凈工作臺(tái)
超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：
（1）風(fēng)速穩(wěn)定，且符合要求；
（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；
（3）讓超凈臺(tái)預(yù)工作10－15分鐘；
（4）使用完畢后，用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。
3、無菌器材
（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；
（2）消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺(tái)、手等。
（3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺(tái)、轉(zhuǎn)椅等物品；無菌操作臺(tái)上一般只允許擺放以下物品： 酒精燈、打火機(jī)、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質(zhì)器等。
三、無菌操作的基本技術(shù)
1、無菌接種操作
培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。 在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。
2. 接種針冷卻
接種針滅菌后，移到酒精燈旁邊冷卻，備用。
配制好固體或液體培養(yǎng)基后，利用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌，經(jīng)過滅菌后培養(yǎng)基里無任何微生物，在超過經(jīng)工作臺(tái)內(nèi)，用接種針等將目標(biāo)菌種接種到培養(yǎng)基中的過程。
劃線分離：
由接種環(huán)沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。
①取菌種：取出目標(biāo)菌種，融化后，備用；
②接種針滅菌：灼燒接種針進(jìn)行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④蘸取菌種：甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種；
⑤劃線：取已經(jīng)備好的固體平板，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環(huán)在平板上劃線，先在一側(cè)連續(xù)劃線3-4次，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈灼燒接種環(huán)，冷卻后，用接種環(huán)穿過第一次劃線部分繼續(xù)劃線3-4次，同樣方法進(jìn)行第三次劃線，或第四次劃線（根據(jù)菌液濃度和菌種類型確定劃線次數(shù)），灼燒接種環(huán)；
⑥標(biāo)記：在平板底部邊緣處標(biāo)記菌種名稱，日期和其他信息；
涂布法接種： 先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，然后用無菌吸管吸取0.1ml 菌液接種在已凝固的瓊脂平板上。再用無菌L 型玻璃棒將菌液在平板上涂抹均勻，將涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。 ①取菌種：取出目標(biāo)菌種平板； ②接種針滅菌：灼燒接種針進(jìn)行滅菌； ③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻； 液體接種 將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上試管塞再輕輕搖勻。 多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)，其操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同。 傾倒法接種： 吸取1ml 菌液加入平板中，倒入已融化并冷卻至45~50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。 螺旋接種法： 可以在無任何全部或中間稀釋的情況下快速細(xì)菌接種。對(duì)數(shù)減少的樣品容量以阿基米德螺旋線的形式被自動(dòng)分注在旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基上每一點(diǎn)的容量可以被知曉和校準(zhǔn)。菌液的濃度可以通過培養(yǎng)皿上一定區(qū)域的菌落數(shù)量除以同區(qū)域樣品分注量來計(jì)算。 
四、微生物檢驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)
（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作； （2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放； （3）在正火焰上方操作； （4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌； （5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)； （6）不能用嘴直接吸吹吸管； （7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。
